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蟾蜍骨髓细胞染色体的制备

2019-06-29 16:03:48 养殖种植技术书籍

蟾蜍骨髓细胞染色体的制备

目的 学会动物骨髓细胞染色体标本制备的基本方法,了解操作步骤的原理。观察动物染色体的形态和数目。

实验前的思考 在间期细胞核中见不到的染色体,只在细胞分裂期呈现。制备动物体细胞典型染色体标本最方便的材料是骨髓细胞。骨髓细胞量多,分裂活跃,取材容易,不需体外培养和无菌操作,便于推广。

材料器具 蟾蜍;普通显微镜,普通托盘天平,手摇离心机,蜡盘,剪刀,镊子,注射器,离心管,吸管,卫生纸;0.075摩尔/升氯化钾低渗液,甲醇乙酸固定液,100微克/毫升秋水仙素,吉姆萨(Giemsa)染液。

步骤

1.配制吉姆萨染液 取吉姆萨1克,甘油66毫升,甲醇66毫升,保存在棕色瓶内成贮备液。在使用时用pH值6.8磷酸缓冲液1∶10稀释。

2.用秋水仙素处理 实验前3.5~4小时,选取幼龄活泼的蟾蜍,称重。按每克体重2微克的剂量,用注射器腹腔注射秋水仙素。由于秋水仙素能抑制纺锤体形成,从而使细胞有丝分裂在中期停止。

3.解剖取材 注射秋水仙素后3.5~4小时,用毁脊髓法处死蟾蜍。在解剖蜡盘中剪开蟾蜍后肢大腿上皮肤和肌肉,暴露出股骨及其两端关节,然后从上端连关节剪下下肢,分离出股骨,用卫生纸剔尽残余肌肉。剪去两端少量软骨,使骨髓暴露。注射器针头插入股骨一端骨髓腔,用盛有5毫升氯化钾低渗液冲洗出腔内骨髓于离心管中,反复冲洗至骨髓腔变白为止(见图)。

4.静置低渗 把获得的骨髓细胞悬液在15~25℃室温下静置20~30分钟。使细胞膨胀,促使中期染色体散开。这一步常常是成败的关键。

5.固定 在低渗结束前1~2分钟,加入新鲜配制的甲醇乙酸(30∶1)1毫升,用吸管吹打混匀。用手摇离心机以800转/分的速度运转5分钟。小心吸去上清液,留下约0.5毫升沉淀物再加入5毫升固定液混匀,静置15~20分钟。再重复运转5分钟,弃去上清液。如果时间允许,为提高标本制片质量,减少杂质,必要时可以再固定一次。

6.滴片 用吸管把离心管留下的0.5毫升固定液跟沉淀细胞吹打混匀,然后取一张洁净载玻片平放桌上,用吹管吸取细胞悬液从10厘米以上高度滴下1~2滴在载玻片中央,轻吹载玻片上液滴加速蒸发,以利染色体铺展。

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